实操指导高压液相色谱操作手册

一、仪器概述

高压液相色谱（HPLC）是一种广泛应用于化学分析的分离技术，它能够将样品中的各个组分按照其在柱上移动的速度进行精确地分离。这种技术通过将样品溶解在流动相中，然后通过柱层和检测系统来实现。

二、安全操作原则

在使用高压液相色谱之前，必须先熟悉并遵守相关的安全规程。首先，要确保所有连接都紧固，并且没有泄漏迹象。在装载柱时，应注意保护自己免受可能飞溅出的有毒或腐蚀性溶剂伤害。此外，在实验过程中要保持良好的通风条件，以防止积聚的有机溶剂挥发物对人体造成危害。

三、高压泵校准与安装

校准步骤：首先检查是否已经完成了必要的校准工作；如果需要重新校准，则按照制造商提供的标准程序进行。

安装步骤：确保泵头与柱之间无空气泡沫存在，并且管道密封牢固。对于多通道装置，正确设置流量控制器以避免混淆或误导测量结果。

四、柱层选择与处理

柱层选择：根据所研究物质类型和目标分析条件选择合适的填料材料，如石英微粒（Si），甲基丙烯酸甲酯-交联多孔聚苯乙烯（C18），氨基酸交联多孔聚苯乙烯（NH2）等。

柱层处理：新购置或存放时间较长后的柱层应进行充分干燥和清洗，以去除可能附着在表面的污染物。通常采用含有大约0.5%由甲醇制成的小量水溶液逐渐注入至最大允许流速下循环冲洗直至澄清为止。

五、高效纯化系统配置及调节

配置要求：根据实际实验需求配置合适的大容量瓶子、大容量滴定瓶、小容量瓶子以及各种配件，如阀门、接头等。

调节步骤：

调整流量控制器使其稳定输出指定流量。

检查并调整吸收皿位置，使之恰当地位于流动相末端以捕获最后一部分含有目标成分的大型缓冲区浸出物。

确保全部管线和阀门均处于正确状态以避免损坏设备或影响数据质量。

六、样品准备与注射技巧

样品准备：

将样品稀释到可接受浓度范围内，即使是高度活性药物也应该被稀释到可以安全注射给动物而不会导致急性毒性反应的地位，这一步通常会涉及用水或者其他非极性的溶剂稀释样本，同时考虑到保存温度和时间因素，尽早开始分析非常重要。

使用无菌方法采集生物学样本，比如血液，可以减少污染风险，因为任何不纯净来源都会引起假阳性结果，从而影响最终实验结果的一致性。

注射技巧：

在每次使用前，都要仔细检查高速注射器针尖是否干净，并确认它未曾用于其他样的目的以防传递污染源，这也是保证数据真实性的关键之一；

确保从同一个点开始注入，以获得一致结果，对于复杂混合物尤为重要；

七、高效率运行模式优化

为了提高HPLC运行效率，可以采用以下策略：

选用具有最佳亲水/疏水特性的填料材料，如辛甘酸交联多孔聚苯乙烯(C8)，这类填料能更有效地隔离不同亲脂力的化合物，从而降低总运行时间并提高信号响应率；

采取梯度洗脱法来代替常规恒定流速方法，不仅可以更好地解决不同化合物间竞争的问题，还能减少试验成本；

利用自动程序设计工具实现连续运行，将一次完整测试转换为连续执行系列测试，每个批次只需简单切换参数即可完成不同的实验任务，而不是每次都重设整个程序。这不仅简化了工作流程，而且提升了实验室管理效率。